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一、测序策略:
链特异性转录组测序(strand-specific RNA sequencing)是指在构建测序文库时,利用Illumina高保真Taq酶将mRNA链的方向信息保存到测序文库中。测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比,它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构,同时可以发现更多的反义转录本,目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领域范围。
建库测序流程如下:
1.1 总RNA样品检测:检测RNA样品的纯度、浓度和完整性;
1.2 文库构建:RNA样品检测合格后,去除rRNA,将mRNA随机打断成段片段,通过逆转录合成双链cDNA并纯化。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头,进行片段大小选择。最后进行PCR扩增,纯化PCR产物,得到文库;
1.3 文库质检:文库构建完成后,先检测文库的插入片段长度,对文库的浓度进行精确定量;
1.4 上机测序:文库质检合格后,进行上机测序。
二、样本要求:
2.1 RNA样品要求(请使用干冰运送):
2.1.1 浓度≥40 ng/μl,总量≥2 μg的RNA;
2.1.2 OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.8,RIN≥7.0,23S:16S≥1.0,RNA无降解无污染,基线平整,5S峰正常。
2.2 菌体样本(请使用干冰运送):
菌体:≥106 个或200 mg。